Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nebulin: sc-404182-ACT

Le gène humain **NEB** code la nébuline, une gigantesque protéine d’échafaudage filamenteuse des filaments fins du muscle squelettique, qui stabilise la F‑actine, détermine la longueur des filaments et favorise l’alignement des sarcomères ainsi que la transmission de la force. La nébuline interagit avec les complexes régulateurs troponine–tropomyosine et avec des composants du disque Z, reliant l’activation contractile à l’organisation du cytosquelette lors de la myofibrillogenèse et du maintien musculaire. Des altérations de l’expression ou de la fonction de **NEB** sont associées à des myopathies structurelles, dont la myopathie némaline, et sont pertinentes pour l’étude de la faiblesse musculaire, du remodelage des types de fibres et de la mécanobiologie dépendante de l’actine. Ces caractéristiques font de **NEB** une cible centrale pour explorer l’assemblage des sarcomères, les sorties du couplage excitation–contraction et la dynamique du cytosquelette d’actine dans des modèles musculaires humains.

Nebulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nebulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nebulin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nebulin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nebulin dans les cellules tumorales présentant une expression de NEB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.