NDUFB5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425783-ACT

Mouse Ndufb5 kodiert NDUFB5, eine akzessorische Untereinheit des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes I (NADH:Ubiquinon-Oxidoreduktase), die die oxidative Phosphorylierung und die zelluläre ATP-Produktion unterstützt. Als Teil des Elektronentransportsystems der inneren Mitochondrienmembran trägt NDUFB5 zur Übertragung von aus NADH stammenden Elektronen, zur Aufrechterhaltung des mitochondrialen Membranpotenzials und zur Regulation der Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies bei. Eine veränderte Funktion von Komplex I ist breit mit metabolischen Stressantworten und Signalwegen der mitochondrialen Dysfunktion verknüpft, die sich mit Neurodegeneration, kardiometabolischen Phänotypen und entzündlicher Signalgebung überschneiden. Ndufb5 ist daher relevant, um zu untersuchen, wie mitochondriale Bioenergetik den zellulären Zustand in Entwicklungs- und Krankheitsmodellen in Maussystemen umgestaltet.

NDUFB5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ndufb5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NDUFB5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ndufb5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ndufb5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NDUFB5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ndufb5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NDUFB5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NDUFB5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ndufb5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.