Plasmide CRISPR d'Activation (h) NCKX6: sc-406101-ACT

SLC8B1 code NCKX6, un échangeur sodium/calcium dépendant du potassium qui contribue à l’homéostasie intracellulaire du Ca²⁺ en couplant les gradients de Na⁺ et de K⁺ à l’efflux de Ca²⁺ à travers les membranes cellulaires. En modulant la dynamique du calcium cytosolique, NCKX6 peut influencer des réseaux de signalisation sensibles au calcium qui régulent l’excitabilité, la sécrétion et les réponses transcriptionnelles en aval. Une altération de la gestion du Ca²⁺ est largement impliquée dans les réponses au stress cellulaire et les dérégulations de signalisation observées dans de multiples contextes pertinents pour les maladies, ce qui fait de SLC8B1 un nœud utile pour des études mécanistiques des voies liées au transport ionique. L’étude de la fonction de NCKX6 soutient la recherche sur la manière dont les processus de transport membranaire s’intègrent aux voies et phénotypes dépendants du calcium dans les cellules humaines.

NCKX6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC8B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NCKX6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC8B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC8B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NCKX6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC8B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NCKX6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NCKX6 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC8B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.