Nanos1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404414-ACT

Das humane NANOS1 kodiert Nanos1, ein evolutionär konserviertes RNA-bindendes Protein, das die posttranskriptionelle Genexpression in Keimzellen reguliert, indem es die Stabilität und Translation von mRNAs moduliert. NANOS1 ist an Programmen zur Aufrechterhaltung und Differenzierung der Keimbahn beteiligt, indem es spezifische Transkripte reprimiert und so Zellschicksalsentscheidungen, Überleben und Zellzykluskontrolle unterstützt. Eine fehlregulierte NANOS1-Aktivität wurde mit gestörter Spermatogenese und männlichen Infertilitätsphänotypen in Verbindung gebracht; zudem wurde eine veränderte Expression in ausgewählten Tumorkontexten beschrieben, in denen keimbahnassoziierte Signalwege ectopisch aktiviert werden. Diese Eigenschaften machen NANOS1 zu einem hilfreichen Knotenpunkt für die Untersuchung von RNA-Regulationsnetzwerken, der Kontrolle entwicklungsbiologischer Genprogramme und von Mechanismen, die Keimbahnfaktoren mit zellulärer Plastizität verknüpfen.

Nanos1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NANOS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nanos1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NANOS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NANOS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nanos1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NANOS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nanos1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nanos1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NANOS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.