MTMR5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410999-ACT

SBF1 kodiert MTMR5, eine katalytisch inaktive, myotubularinverwandte Pseudophosphatase, die als Gerüstprotein in der Phosphoinositid-Signalübertragung und beim endosomalen Membrantransport fungiert. MTMR5 interagiert mit aktiven Myotubularinen wie MTMR2, um die Homöostase von Phosphatidylinositol-3-phosphat und Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat zu regulieren, und beeinflusst dadurch Endosom–Lysosom-Dynamik, Rezeptor-Turnover und die Organisation des Zytoskeletts. Über diese Prozesse wurde SBF1 mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die Myelinisierung, axonale Erhaltung und zelluläre Stressantworten steuern. Genetische Varianten und eine dysregulierte Expression in dieser Achse stehen mit erblichen Neuropathie-Phänotypen sowie mit breiteren neuroentwicklungsbezogenen und tumorbiologischen Zusammenhängen in Verbindung, in denen trafficking-abhängige Signalgebung verändert ist.

MTMR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SBF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MTMR5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SBF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SBF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MTMR5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SBF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MTMR5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MTMR5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SBF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.