MTAP CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-426257-ACT-2

Das murine Mtap-Gen kodiert die Methylthioadenosin-Phosphorylase (MTAP), ein Schlüsselenzym des Methionin-Salvage-Wegs, das die Phosphorolyse von 5′-Methylthioadenosin katalysiert, um das Recycling von Adenin und Methionin zu ermöglichen und den zellulären Purinstoffwechsel aufrechtzuerhalten. Die MTAP-Aktivität verknüpft den Abbau von Nebenprodukten der Polyaminbiosynthese mit dem Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel und der Methylierungskapazität und beeinflusst dadurch Nukleotidpools, Redoxgleichgewicht und proliferative Homöostase. Ein Verlust oder eine Verminderung der MTAP-Funktion ist in krebsrelevanten Kontexten häufig mit veränderten metabolischen Abhängigkeiten und genomischer Instabilität assoziiert, oft in räumlicher Nähe zu Störungen am Cdkn2a-Lokus. Werkzeuge zur Genomeditierung des Mtap-Gens in der Maus ermöglichen mechanistische Studien zur metabolischen Umprogrammierung, epigenetischen Regulation und zu Zellzustandsübergängen und unterstützen in vivo- und in vitro-Modelle zur Analyse der Signalweg- und Stoffwechselweg-Kreuzregulation in Entwicklungs- und Krankheitsbiologie.

MTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mtap-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mtap-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mtap-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MTAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mtap-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MTAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MTAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mtap-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.