Plasmide CRISPR d'Activation (h) MRP5: sc-402443-ACT

ABCC5 code le transporteur humain de la famille ATP‑binding cassette MRP5 (ABCC5), une pompe d’efflux de la membrane plasmique qui exporte des nucléotides cycliques tels que le cGMP et le cAMP, ainsi que certains analogues nucléosidiques et des anions organiques. En contrôlant les pools intracellulaires de nucléotides cycliques, MRP5 peut influencer les voies de signalisation cGMP/PKG et cAMP/PKA, avec des effets en aval sur la régulation du tonus vasculaire, la réactivité plaquettaire et les réponses cellulaires au stress. L’expression d’ABCC5 et l’activité de ce transporteur sont fréquemment étudiées dans le contexte de la prise en charge des xénobiotiques et des phénotypes de résistance multidrogue, où une capacité d’efflux modifiée peut remodeler l’exposition intracellulaire aux métabolites et aux analogues de médicaments. Une dérégulation d’ABCC5 a été associée à des modifications, pertinentes pour la maladie, de l’homéostasie de la signalisation et du transport, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la régulation médiée par les transporteurs.

MRP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ABCC5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MRP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ABCC5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ABCC5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MRP5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ABCC5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MRP5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MRP5 dans les cellules tumorales présentant une expression de ABCC5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.