MRP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401912-ACT

Humanes ABCC4 kodiert MRP4 (Multidrug-Resistance-Associated Protein 4), einen ATP-bindenden Kassettentransporter, der den ATP-abhängigen Efflux organischer Anionen vermittelt, darunter zyklische Nukleotide (cAMP/cGMP), Prostaglandine, Leukotriene, Gallensäurekonjugate sowie verschiedene xenobiotische Metaboliten. Durch die Regulation intrazellulärer Second Messenger und Lipidmediatoren beeinflusst MRP4 die GPCR-Signalübertragung, Entzündungs- und vaskuläre Homöostasewege sowie zelluläre Stressantworten. Die ABCC4-Aktivität prägt zudem die Pharmakokinetik und die zelluläre Exposition gegenüber Nukleosidanaloga und anderen kleinen Molekülen durch transportvermittelte Clearance. Eine dysregulierte ABCC4/MRP4-Expression wurde in verschiedenen Krankheitskontexten mit veränderter inflammatorischer Signalgebung und transporterassoziierten Phänotypen der Arzneimittelantwort in Verbindung gebracht, was ABCC4 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der Transporterbiologie und des Signalweg-Crosstalks macht.

MRP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCC4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MRP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCC4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCC4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MRP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCC4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MRP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MRP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCC4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.