MLL2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401659-ACT

KMT2D (MLL2) codifica una metiltransferasi delle lisine istoniche contenente un dominio SET, che catalizza la mono- e di-metilazione di H3K4 negli enhancer, plasmando l’accessibilità della cromatina e programmi trascrizionali specifici di linea cellulare. Attraverso interazioni con complessi di tipo COMPASS, MLL2 coordina l’attivazione degli enhancer, il reclutamento dell’RNA polimerasi II e la regolazione genica a lungo raggio, aspetti importanti per lo sviluppo e l’identità cellulare. L’alterazione del controllo epigenetico associato a KMT2D è collegata a stati di differenziazione modificati, risposte al danno al DNA e un’ampia disregolazione trascrizionale osservata in diversi contesti oncologici e di malattie dello sviluppo. In quanto regolatore dei paesaggi degli enhancer, KMT2D è ampiamente studiato in vie che governano la specificazione del destino cellulare, la segnalazione immunitaria e il controllo della proliferazione dipendente dalla cromatina.

MLL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KMT2D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MLL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KMT2D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KMT2D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MLL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KMT2D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MLL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MLL2 nelle cellule tumorali con espressione di KMT2D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.