MLK3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401781-ACT

MAP3K11 codifica per la mixed lineage kinase 3 (MLK3) umana, una MAP3K che integra diversi segnali a monte legati a stress e citochine con la segnalazione MAPK a valle, incluse le cascate JNK e p38. Attraverso la fosforilazione di MAP2K come MKK4/7 e MKK3/6, MLK3 contribuisce a regolare programmi trascrizionali che controllano infiammazione, apoptosi, rimodellamento del citoscheletro e migrazione cellulare. L’attività di MLK3 è associata a reti di segnalazione a valle di piccole GTPasi e di vie recettoriali che modellano le risposte cellulari allo stress e gli output dell’immunità innata. Una segnalazione MAP3K11/MLK3 deregolata è stata implicata in contesti patologici caratterizzati da un’attivazione MAPK aberrante, incluse adattamenti della segnalazione oncogena e processi neuroinfiammatori o neurodegenerativi.

MLK3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP3K11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MLK3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP3K11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP3K11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MLK3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP3K11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MLK3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MLK3 nelle cellule tumorali con espressione di MAP3K11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.