MKP-7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405727-ACT

DUSP16 kodiert die mitogen-aktivierte Proteinkinase-Phosphatase 7 (MKP-7), eine dualspezifische Phosphatase, die die MAPK-Signalübertragung abschwächt, indem sie stressaktivierte Kinasen dephosphoryliert; dabei wird in der Literatur eine Präferenz für die JNK- und p38-Signalwege beschrieben. Über eine negative Rückkopplungskontrolle der MAPK-Kaskaden beeinflusst MKP-7 stimulusabhängige Transkriptionsprogramme, die Proliferation, Differenzierung und Apoptose steuern. Eine fehlregulierte DUSP16-Aktivität wurde in der Literatur mit veränderter inflammatorischer Signalgebung und einer tumorassoziierten Umgestaltung des MAPK-Netzwerks in Verbindung gebracht, was sie zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Signalweg-Homöostase macht. Als zytosolischer Regulator kinasengetriebener Antworten wird MKP-7 häufig in Kontexten der Zytokinsignalgebung, der zellulären Stressanpassung und des Crosstalks immunbezogener Signalwege untersucht.

MKP-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DUSP16-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MKP-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DUSP16-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DUSP16-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MKP-7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DUSP16-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MKP-7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MKP-7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DUSP16-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.