MKP-7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405727-ACT

DUSP16 codifica la fosfatasi 7 delle chinasi attivate da mitogeni (MKP-7), una fosfatasi a doppia specificità che attenua la segnalazione MAPK defosforilando chinasi attivate dallo stress, con una preferenza riportata per le vie JNK e p38. Attraverso un controllo a feedback negativo delle cascate MAPK, MKP-7 influenza programmi trascrizionali dipendenti dallo stimolo che regolano proliferazione, differenziamento e apoptosi. Un’attività disfunzionale di DUSP16 è stata collegata in letteratura ad alterazioni della segnalazione infiammatoria e al rimodellamento, associato ai tumori, della rete MAPK, rendendolo un nodo utile per studiare l’omeostasi delle vie di segnalazione. In quanto regolatore citosolico delle risposte guidate da chinasi, MKP-7 è spesso analizzato in contesti di segnalazione delle citochine, adattamento allo stress cellulare e crosstalk tra vie correlate al sistema immunitario.

MKP-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DUSP16 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MKP-7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DUSP16 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DUSP16, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MKP-7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DUSP16 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MKP-7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MKP-7 nelle cellule tumorali con espressione di DUSP16 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.