MITF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400401-ACT

Der microphthalmieassoziierte Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein linienbestimmender bHLH-LZ-Transkriptionsfaktor, der Programme reguliert, welche die Entwicklung von Melanozyten, Pigmentierung, das Überleben und die Differenzierung steuern. In menschlichen Zellen integriert MITF Signaleingänge aus Signalwegen wie MAPK/ERK und cAMP/PKA, um die Transkription von Genen zu koordinieren, die an der Biogenese von Melanosomen, an Reaktionen auf oxidativen Stress, an der lysosomalen Funktion und am zellulären Stoffwechsel beteiligt sind. Eine fehlregulierte MITF-Aktivität wurde mit veränderten melanocytären Zellzuständen, Pigmentierungsstörungen und der Melanom-Biologie in Verbindung gebracht, wobei Veränderungen in MITF-abhängigen transkriptionellen Netzwerken Proliferation, Invasion und die Anpassung an Stress beeinflussen können. Als zentraler transkriptioneller Knotenpunkt wird MITF häufig als molekularer Ansatzpunkt genutzt, um Zellidentität, transkriptionelle Plastizität und signalabhängige Genregulation zu untersuchen.

MITF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MITF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MITF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MITF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MITF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MITF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MITF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MITF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MITF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MITF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.