MESP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404176-ACT

MESP1 (mesoderm posterior basic helix-loop-helix transcription factor 1) ist ein Masterregulator der frühen Mesendoderm-Spezifizierung und der Festlegung der kardiovaskulären Zelllinie in der menschlichen Entwicklung. Als bHLH-Transkriptionsfaktor koordiniert MESP1 Transkriptionsprogramme, die gastrulationsassoziierte Zellschicksalsentscheidungen, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und die Migration von Vorläuferzellen steuern, und wirkt dabei stromaufwärts von Netzwerken, die das Mesoderm musterbilden und die Kardiogenese einleiten. Eine fehlregulierte MESP1-Aktivität kann Differenzierungsverläufe stören und wurde mit Entwicklungsdefekten sowie einer veränderten Linienplastizität in Zusammenhang gebracht, die für die Biologie angeborener Herzfehler und für Krankheitsmodelle mit Stammzellen relevant sind. In vitro unterstützt die kontrollierte Modulation von MESP1 mechanistische Untersuchungen früher entwicklungsbiologischer Genregulationsnetzwerke und Differenzierungsprotokolle für aus dem Mesoderm abgeleitete Zelltypen.

MESP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MESP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MESP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MESP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MESP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MESP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MESP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MESP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MESP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MESP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.