MELK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403062-ACT

Die maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die an der Regulation des Fortschreitens des Zellzyklus, der Kontrolle des mitotischen Checkpoints und proliferationsassoziierter Transkriptionsprogramme beteiligt ist. Die MELK-Aktivität wurde mit stammzellähnlichen Phänotypen, zellulären Stressantworten sowie der Kopplung von Mitose und Überlebenssignalen über Signalwege in Verbindung gebracht, die sich mit MAPK-, FOXM1-assoziierten Netzwerken und anderen kinasegesteuerten Prozessen überschneiden. Eine veränderte MELK-Expression wurde in mehreren Tumorkontexten beschrieben und wird häufig als Biomarker für die Proliferationskapazität und Linienplastizität untersucht. Diese Eigenschaften machen MELK zu einem nützlichen Knotenpunkt, um mitotische Regulation, metabolische Anpassung und das Umverdrahten von Signalwegen in krankheitsrelevanten Zellmodellen zu untersuchen.

MELK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MELK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MELK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MELK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MELK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MELK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MELK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MELK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MELK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MELK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.