Plásmido CRISPR de Activación (h) ME1: sc-401587-ACT

El ME1 humano codifica la enzima málica 1 citosólica dependiente de NADP, que cataliza la conversión de malato en piruvato mientras genera NADPH para la biosíntesis reductora y la defensa antioxidante. Al aportar NADPH, ME1 favorece la síntesis de ácidos grasos y colesterol, mantiene el equilibrio redox mediante el reciclaje de glutatión y conecta intermediarios de la glucólisis y del ciclo del TCA con el metabolismo anabólico. La actividad de ME1 se cruza con el metabolismo central del carbono y con vías dependientes de NADPH que influyen en la proliferación celular, las respuestas al estrés oxidativo y los programas de diferenciación. La expresión alterada de ME1 se ha asociado con la reprogramación metabólica observada en diversos contextos relevantes para enfermedades, incluido el metabolismo del cáncer, la resistencia a la insulina y la desregulación lipídica, lo que lo convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos.

ME1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ME1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ME1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ME1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ME1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ME1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ME1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ME1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ME1 en células tumorales con expresión de ME1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.