MDR3/ABCB4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404167-ACT

ABCB4 (MDR3) codifica un trasportatore della famiglia degli ATP-binding cassette localizzato nella membrana canalicolare degli epatociti, dove media la traslocazione ATP-dipendente della fosfatidilcolina nella bile. Questo processo di trasporto lipidico sostiene la formazione della bile e contribuisce a mantenere l’integrità della membrana biliare modulando la composizione della bile, intersecandosi con l’omeostasi lipidica epatica e con le vie di traffico di membrana. Un’attività disregolata di MDR3/ABCB4 altera l’equilibrio dei fosfolipidi biliari ed è associata a fenotipi epatici colestatici e a danno epatobiliare. Di conseguenza, ABCB4 è ampiamente studiato in modelli di accoppiamento acidi biliari–fosfolipidi, polarità degli epatociti e regolazione dei trasportatori nella fisiologia del fegato.

MDR3/ABCB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDR3/ABCB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDR3/ABCB4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDR3/ABCB4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDR3/ABCB4 nelle cellule tumorali con espressione di ABCB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.