Plasmide CRISPR d'Activation (h) MDR3/ABCB4: sc-404167-ACT

ABCB4 (MDR3) code un transporteur de la famille des « ATP-binding cassette » localisé à la membrane canaliculaire des hépatocytes, où il assure la translocation dépendante de l’ATP de la phosphatidylcholine vers la bile. Ce processus de transport lipidique soutient la formation de la bile et contribue au maintien de l’intégrité de la membrane biliaire en modulant la composition de la bile, à l’interface avec l’homéostasie lipidique hépatique et les voies de trafic membranaire. Une activité dérégulée de MDR3/ABCB4 modifie l’équilibre des phospholipides biliaires et est associée à des phénotypes hépatiques cholestatiques ainsi qu’à des lésions hépatobiliaires. En conséquence, ABCB4 est largement étudié dans des modèles de couplage acides biliaires–phospholipides, de polarité des hépatocytes et de régulation des transporteurs en physiologie hépatique.

MDR3/ABCB4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ABCB4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MDR3/ABCB4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ABCB4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ABCB4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MDR3/ABCB4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ABCB4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MDR3/ABCB4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MDR3/ABCB4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ABCB4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.