MDC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405652-ACT

Mediator of DNA Damage Checkpoint 1 (MDC1) ist ein nukleäres Scaffold-Protein, das die Signalübertragung bei DNA-Doppelstrangbrüchen verstärkt, indem es an phosphoryliertes H2AX (γH2AX) bindet und die Rekrutierung von Reparatur- und Checkpoint-Faktoren koordiniert. Über Interaktionen, die die ATM-abhängige Signalgebung unterstützen, fördert MDC1 die Aktivierung des DNA-Schadens-Checkpoints, das Chromatin-Remodeling an Bruchstellen sowie die Pfadwahl zwischen homologer Rekombination und nicht-homologem End-Joining. Durch die Stabilisierung von Schadensfoci und die Weiterleitung ubiquitinabhängiger Signalkaskaden trägt MDC1 zur Genomintegrität bei Replikationsstress und nach genotoxischer Belastung bei. Eine veränderte Funktion oder Expression von MDC1 wurde mit Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und für erbliche Defekte in Netzwerken der DNA-Schadensantwort relevant sind.

MDC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MDC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MDC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MDC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MDC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MDC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.