MDA5 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-427977-LAC

Ifih1 del topo codifica la proteina 5 associata alla differenziazione del melanoma (MDA5), un’elicasi dell’RNA citosolica della famiglia DExD/H-box che rileva lunghi RNA a doppio filamento generati durante la replicazione virale. Dopo il legame con l’RNA, MDA5 segnala attraverso MAVS per attivare TBK1/IKKε e, a valle, i programmi di IRF3/IRF7 e NF-κB, inducendo interferoni di tipo I e geni stimolati dagli interferoni. Questa via modella l’immunità antivirale innata, dialoga con l’autofagia e con risposte associate all’inflammasoma e influenza la presentazione dell’antigene e il tono infiammatorio. Una segnalazione di MDA5 deregolata è stata implicata in firme interferoniche aberranti e in patologie immunomediate, rendendo Ifih1 un nodo utile per analizzare l’attivazione dell’immunità innata e fenotipi rilevanti per l’infiammazione nei modelli murini.

Le particelle di attivazione lentivirale MDA5 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Ifih1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale MDA5 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Ifih1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di MDA5. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Ifih1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.