MBL-C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403131-ACT

MBL2 kodiert Mannose-bindendes Lektin (MBL-C), ein lösliches Mustererkennungsprotein des angeborenen Immunsystems, das an mannose- und fucosereiche Glykane auf mikrobiellen Oberflächen sowie an veränderte körpereigene Strukturen bindet. Nach Ligandenbindung bildet MBL-C Komplexe mit MASP-Proteasen und initiiert dadurch den Lektinweg des Komplementsystems, was Opsonierung, inflammatorische Signalgebung und die Beseitigung von Pathogenen sowie apoptotischem Zellmaterial fördert. Veränderungen in der MBL2-Expression oder -Funktion wurden mit einer veränderten Komplementaktivität und einer veränderten Anfälligkeit für infektiöse und entzündliche Phänotypen in Verbindung gebracht, was MBL2 zu einem geeigneten Ansatzpunkt für die Untersuchung der humoralen angeborenen Immunität macht. In Zell- und Gewebemodellen liefert die Regulation von MBL2 ein gut handhabbares Readout für komplementassoziierte Signalwege und Wirtsabwehrmechanismen.

MBL-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MBL-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MBL-C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MBL-C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MBL-C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.