Plásmido CRISPR de Activación (h) Lsh: sc-402466-ACT

El gen humano **HELLS** codifica la helicasa específica de linfocitos (Lsh), un remodelador de cromatina dependiente de ATP de la familia SNF2 que coopera con las metiltransferasas de ADN para establecer y mantener la metilación del ADN y la organización de la heterocromatina. Lsh favorece el ensamblaje de la cromatina acoplado a la replicación, el silenciamiento de repeticiones pericentroméricas y la estabilidad del genoma al regular el posicionamiento de los nucleosomas y la estructura de la cromatina de orden superior. A través de estas funciones epigenéticas, HELLS influye en programas transcripcionales que controlan la progresión del ciclo celular y la diferenciación, y su desregulación se asocia con paisajes de metilación alterados y fenotipos de inestabilidad genómica observados en múltiples contextos de enfermedad. Por ello, HELLS se estudia ampliamente en vías que gobiernan la herencia epigenética, la represión de transposones y la remodelación de la cromatina vinculada a la reparación del ADN.

Lsh El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HELLS sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Lsh El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HELLS en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HELLS, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Lsh. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HELLS y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Lsh en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Lsh en células tumorales con expresión de HELLS silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.