Plasmide CRISPR d'Activation (h) Limkain b1: sc-411308-ACT

KIAA0430 code la limkaïne b1, une protéine humaine impliquée dans l’organisation du cytosquelette et dans des processus associés à l’actine qui façonnent la morphologie cellulaire, l’adhésion et la motilité. Les études sur les protéines de la famille Limkain suggèrent des liens avec des voies de signalisation qui couplent la dynamique membranaire au remodelage de l’actine, soutenant des changements coordonnés de l’architecture cellulaire. Une régulation altérée des réseaux actine–cytosquelette est fréquemment associée, dans le cancer, à des phénotypes de prolifération, de migration et d’invasion dérégulés, ainsi qu’à une connectivité neuronale altérée dans des contextes neurodéveloppementaux. La caractérisation de l’expression et de la fonction de la limkaïne b1 peut aider à préciser comment le contrôle du cytosquelette s’articule avec des programmes transcriptionnels et de signalisation plus larges, pertinents pour les transitions d’état cellulaire associées aux maladies.

Limkain b1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KIAA0430 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Limkain b1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KIAA0430 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KIAA0430, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Limkain b1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KIAA0430 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Limkain b1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Limkain b1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KIAA0430 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.