Legumain Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402437-ACT

LGMN umano codifica la legumaina, un’endopeptidasi asparaginilica lisosomiale che promuove il processamento proteolitico di substrati intracellulari ed extracellulari in condizioni acide. La legumaina partecipa al turnover proteico endolisosomiale, alle vie di processamento dell’antigene nelle cellule immunitarie e al rimodellamento della matrice extracellulare tramite l’attivazione di altre proteasi e la scissione di proteine associate alla matrice. Un’espressione e un’attività di LGMN deregolate sono state associate a infiammazione, fibrosi e biologia del microambiente tumorale, in cui reti proteasiche alterate possono influenzare invasione, angiogenesi e modulazione immunitaria. Di conseguenza, LGMN è ampiamente studiato in relazione alla funzione dei lisosomi, alla proteostasi e alla segnalazione mediata da proteasi, con rilevanza per contesti oncologici e neuroinfiammatori.

Legumain Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LGMN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Legumain Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LGMN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LGMN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Legumain. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LGMN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Legumain nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Legumain nelle cellule tumorali con espressione di LGMN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.