Plasmide CRISPR d'Activation (r) LDH-A: sc-437361-ACT

La lactate déshydrogénase A (LDH-A) est une oxydoréductase cytosolique qui catalyse l’interconversion du pyruvate et du lactate, avec recyclage concomitant du NADH/NAD⁺, soutenant la production d’ATP glycolytique en situation de flux glycolytique élevé. Dans les cellules de rat, l’activité de la LDH-A contribue au maintien de l’équilibre rédox et de la production de lactate, influençant le flux de carbone entre la glycolyse et le métabolisme mitochondrial et participant aux réponses cellulaires à l’hypoxie et au stress nutritionnel. Le métabolisme du lactate dépendant de la LDH-A module le microenvironnement métabolique et interagit avec des voies qui régulent la prolifération, l’inflammation et le stress oxydatif. Une expression ou une activité dérégulée de la LDH-A est fréquemment étudiée comme caractéristique du remodelage métabolique en biologie du cancer ainsi que dans des modèles de lésions tissulaires ischémiques ou inflammatoires.

LDH-A Le plasmide d'activation CRISPR (r) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LDH-A Le plasmide d'activation CRISPR (r) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription , où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LDH-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LDH-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LDH-A dans les cellules tumorales présentant une expression de silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.