LASS4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406329-ACT

CERS4 (LASS4) kodiert die Ceramid-Synthase 4, ein membranständiges Enzym des endoplasmatischen Retikulums, das Sphingoidbasen acyliert und so spezifische langkettige Ceramid-Spezies erzeugt. Durch die Kontrolle der Ceramidzusammensetzung beeinflusst LASS4 die sphingolipidabhängige Membranorganisation sowie Signalprozesse, die mit Apoptose, zellulären Stressantworten und metabolischer Homöostase verknüpft sind. Veränderte Ceramidsynthese und Sphingolipid-Remodelling wurden mit fehlregulierter Proliferation, Entzündung und neuro-metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch CERS4 ein hilfreicher Knotenpunkt für die Untersuchung von Lipidsignalen und Organellen-Stresswegen ist. Die funktionelle Untersuchung von CERS4 unterstützt mechanistische Studien zur ceramidgetriebenen Regulation von Zellschicksal, Barrierefunktion und lipidvermittelter Signaltransduktion.

LASS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CERS4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LASS4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CERS4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CERS4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LASS4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CERS4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LASS4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LASS4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CERS4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.