LASS4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406329-ACT

CERS4 (LASS4) codifica la ceramide sintasi 4, un enzima di membrana del reticolo endoplasmatico che acila le basi sfingoidi per generare specifiche specie di ceramidi a catena lunga. Controllando la composizione delle ceramidi, LASS4 influenza l’organizzazione di membrana e i processi di segnalazione dipendenti dagli sfingolipidi, collegati ad apoptosi, risposte cellulari allo stress e omeostasi metabolica. Un’alterata sintesi di ceramidi e il rimodellamento degli sfingolipidi sono stati associati a proliferazione disregolata, infiammazione e fenotipi neuro-metabolici, rendendo CERS4 un nodo utile per studiare la segnalazione lipidica e le vie di stress degli organelli. L’analisi funzionale di CERS4 supporta studi meccanicistici sulla regolazione del destino cellulare guidata dalle ceramidi, sulla funzione di barriera e sulla trasduzione del segnale mediata dai lipidi.

LASS4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CERS4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LASS4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CERS4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CERS4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LASS4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CERS4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LASS4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LASS4 nelle cellule tumorali con espressione di CERS4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.