LASS2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403112-ACT

Humanes CERS2 (auch als LASS2 bekannt) kodiert die Ceramid-Synthase 2, ein Schlüsselenzym der de-novo-Sphingolipidbiosynthese, das bevorzugt sehr langkettige Ceramide erzeugt. Durch die Kontrolle der Zusammensetzung der Ceramid-Kettenlängen beeinflusst LASS2 die Biophysik von Membranen, die Organisation von Lipid Rafts sowie nachgeschaltete Signalprozesse, die mit Apoptose, Autophagie und Stressantworten verknüpft sind. Das CERS2-abhängige Sphingolipid-Remodeling integriert sich in die Homöostase des ER und die mitochondriale Funktion und kann Signalwege modulieren, die Zellwachstum, Differenzierung und inflammatorische Signalgebung beeinflussen. Eine dysregulierte Ceramidmetabolisierung unter Beteiligung von CERS2 wurde in experimentellen Systemen mit Krebsbiologie, metabolischer Dysfunktion sowie Mechanismen neurodegenerativer oder leberbezogener Erkrankungen in Verbindung gebracht.

LASS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CERS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LASS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CERS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CERS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LASS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CERS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LASS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LASS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CERS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.