L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-419403
- Zielspezies: mouse
- 20 µg transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA; geeignet für 20 Transfektionen
- L-type Ca++ CP α1D Das CRISPR/Cas9-Knockout (KO)-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes für die Cas9-Nuklease und eine zielspezifische 20-nt-Guide-RNA (gRNA) kodiert, die für maximale Knockout-Effizienz unter Verwendung von Sequenzen aus der GeCKO v2-Bibliothek entwickelt wurde
- gRNA-Sequenzen lenken Cas9 so, dass es ortsspezifische Doppelstrangbrüche (DSBs) im L-type Ca++ CP α1D-Genomlokus induziert, was zu einem Gen-Knockout durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) führt
- L-type Ca++ CP α1D HDR-Plasmid (m) (sc-419403-HDR) wird für die Co-Transfektion mit dem L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) empfohlen, um die Selektion erfolgreich editierter Zellen durch HDR-vermittelte Integration einer Puromycin-Resistenzkassette und eines RFP-Reportergens zu ermöglichen
- Das L-type Ca++ CP α1D HDR-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes eine HDR-Matrize (Homology-Directed Repair) enthält, die den gRNA-Zielstellen im L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) entspricht
- Jedes HDR-Plasmid enthält zwei ~800 bp lange Homologiearme, die die Puromycin-Resistenz- und RFP-Kassetten flankieren und so konzipiert sind, dass sie an genomische DNA-Sequenzen binden, die die durch Cas9 induzierte Doppelstrangbruchstelle umgeben, und eine präzise HDR-vermittelte Integration ermöglichen
- Die Puromycin-Resistenz- und RFP-Gene werden von LoxP-Stellen flankiert, was die Entfernung der Selektionsmarker mittels Cre-Rekombinase (Cre-Vektor: sc-418923) nach der Etablierung stabiler Knockout-Zelllinien ermöglicht
- Nach der Transfektion kann die Effizienz des Gen-Knockouts per Western Blot oder histologisch mit folgendem Antikörper überprüft werden: L-type Ca++ CP α1D: sc-515679
Bestellinformation
| Produkt | Katalog # | EINHEIT | Preis | ANZAHL | Favoriten | |
L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) | sc-419403 | 20 µg | $397.00 | |||
L-type Ca++ CP α1D HDR Plasmid (m) | sc-419403-HDR | 20 µg | $445.00 |
Übersicht
Cacna1d kodiert in der Maus die porenbildende α1D‑Untereinheit der L‑Typ‑spannungsabhängigen Calciumkanäle (Cav1.3) und ermöglicht einen durch Depolarisation ausgelösten Ca2+-Einstrom, der elektrische Aktivität mit intrazellulärer Signalübertragung koppelt. Cav1.3‑Kanäle prägen die Membranerregbarkeit, regulieren die calciumabhängige Genexpression und beeinflussen über Ca2+/Calmodulin‑abhängige Signalwege sowie nachgeschaltete Kinasekaskaden die Neurotransmitter‑ und Hormonsekretion. In erregbaren Geweben trägt die CACNA1D‑Aktivität zu synaptischer Plastizität und Schrittmacherverhalten bei; veränderte Kanalfunktion wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und dysregulierter endokriner Signalgebung in Verbindung gebracht. Als zentraler Determinant der Calciumhomöostase bietet CACNA1D einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um aktivitätsabhängige Transkriptionsprogramme und Ca2+-getriebene zelluläre Zustandsübergänge zu untersuchen.
L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Cacna1d-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Cacna1d-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.
Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.
Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter
Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das L-type Ca++ CP α1D HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Cacna1d Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem L-type Ca++ CP α1D CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):
- Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Cacna1d offene Lesegerüst.
Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.
Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem
Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Cacna1d-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:
- Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen
Hauptmerkmale
- gRNA, die auf Cacna1d Exon(e) abzielt, die für die L-type Ca++ CP α1D Funktion entscheidend sind
Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert
Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.