KV1.4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405990-ACT

KCNA4 kodiert den spannungsabhängigen Kaliumkanal KV1.4 des Menschen, eine Shaker-verwandte α‑Untereinheit, die sich zu tetrameren Kanälen zusammenlagert und schnell inaktivierende A‑Typ‑K⁺‑Ströme vermittelt. Durch die Beeinflussung der Repolarisation des Aktionspotenzials, der Interspike‑Intervalle und der synaptischen Erregbarkeit trägt KV1.4 zur aktivitätsabhängigen Kontrolle des Membranpotenzials in erregbaren Geweben bei. Verfügbarkeit und Gating des Kanals werden durch Phosphorylierung und Protein‑Protein‑Interaktionen reguliert, die Trafficking und Stabilität an der Zelloberfläche beeinflussen und KCNA4 mit übergeordneten Signalprozessen verknüpfen, welche die neuronale und kardiale Erregbarkeit feinabstimmen. Ein verändertes Gleichgewicht von Strömen der KV1‑Familie wurde in Modellsystemen mit gestörten elektrischen Signalphänotypen in Verbindung gebracht, die für Untersuchungen zu arrhythmogenen Mechanismen, Anfallsanfälligkeit und Erregbarkeitsstörungen relevant sind.

KV1.4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNA4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KV1.4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNA4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNA4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KV1.4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNA4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KV1.4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KV1.4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNA4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.