KIF3A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403463-ACT

KIF3A kodiert eine Untereinheit des Kinesin-2-Motors, die einen ATP-abhängigen anterograden Transport entlang von Mikrotubuli antreibt und für den intraflagellären Transport sowie den Aufbau des primären Ziliums essenziell ist. Über seine Funktion im ziliären Transport unterstützt KIF3A Signaloutputs der Hedgehog- und Wnt-Signalwege, die von einer korrekten Ziliumstruktur und einer zuverlässigen Frachtzustellung abhängen. Die Aktivität von KIF3A trägt zur epithelialen Polarität, zur neuronalen Entwicklung und zu koordinierter Zellsignalgebung an der Centrosom–Zilium-Achse bei. Eine fehlregulierte ziliäre Transport- und Signalgebung im Zusammenhang mit KIF3A wurde mit ciliopathieassoziierten Phänotypen sowie mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die die Biologie der Atemwege und das Verhalten von Tumorzellen beeinflussen.

KIF3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KIF3A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KIF3A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KIF3A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KIF3A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KIF3A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KIF3A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KIF3A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KIF3A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KIF3A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.