IRS-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400096-ACT

Das humane IRS1-Gen kodiert das Insulinrezeptor-Substrat 1 (IRS-1), ein zentrales Adapterprotein, das aktivierte Insulin- und IGF‑1‑Rezeptoren mit nachgeschalteten PI3K–AKT–mTOR- und RAS–MAPK-Signalwegen koppelt. Über die tyrosinphosphorylierungsabhängige Rekrutierung von SH2-Domänen-Effektoren reguliert IRS‑1 die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Proteintranslation, Zellwachstum und das Überleben von Zellen, während Serin/Threonin-Phosphorylierungen eine zentrale negative Rückkopplungskontrolle vermitteln. Dysregulierte IRS‑1‑Signalgebung und Muster posttranslationaler Modifikationen werden in Studien zu Insulinresistenz, metabolischem Stress und wachstumsfaktorgetriebenen Phänotypen häufig als molekulare Readouts verwendet. Veränderte IRS1-Expression oder die Konnektivität innerhalb des Signalnetzwerks wurden zudem in Kontexten wie Typ‑2‑Diabetes, adipositasassoziierter Inflammation und dem Stoffwechsel von Krebszellen untersucht.

IRS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRS-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRS-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRS-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.