IRBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403810-ACT

RBP3 kodiert das interphotorezeptorale Retinoid-bindende Protein (IRBP), ein sezerniertes Glykoprotein, das in der interphotorezeptoralen Matrix angereichert ist. Dort bindet und transportiert es Retinoide zwischen Photorezeptoren und dem retinalen Pigmentepithel (RPE), um den visuellen (Retinoid‑)Zyklus zu unterstützen. Durch die Regulierung der Verfügbarkeit und des Transports von 11‑cis‑ und all‑trans‑Retinoiden trägt IRBP zur Aufrechterhaltung der Homöostase der Photorezeptoren bei und beeinflusst oxidativen sowie metabolischen Stress in der äußeren Retina. Eine veränderte Expression oder Funktion von RBP3/IRBP ist mit retinalen Funktionsstörungen und Degenerationsphänotypen assoziiert und stellt damit einen nützlichen molekularen Ansatzpunkt dar, um die Kopplung zwischen Photorezeptoren und RPE, die Biologie der extrazellulären Matrix und retinoidabhängige Signalwege zu untersuchen. RBP3 wird daher häufig in Modellen erblicher und erworbener Netzhauterkrankungen untersucht, um Mechanismen eines gestörten visuellen Zyklus und die Vulnerabilität von Photorezeptoren zu analysieren.

IRBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.