INSIG-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402255-ACT

INSIG2 codifica INSIG-2, una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico che limita l’attivazione della sterol regulatory element-binding protein (SREBP) favorendo la ritenzione del complesso SCAP–SREBP nel RE in condizioni di abbondanza di steroli. Attraverso questo checkpoint di rilevamento degli steroli, INSIG-2 contribuisce a coordinare la biosintesi di colesterolo e acidi grassi con la disponibilità di lipidi cellulari e interagisce con le vie di ubiquitinazione associate al RE che regolano enzimi metabolici. Alterazioni dell’espressione o della funzione di INSIG2 sono state associate a lipogenesi deregolata e a uno squilibrio dell’omeostasi del colesterolo, con correlazioni riportate con fenotipi metabolici tra cui insulino-resistenza, tratti legati all’obesità e accumulo lipidico epatico. Come nodo di via, INSIG-2 è ampiamente utilizzato per studiare il controllo trascrizionale del metabolismo lipidico, il crosstalk tra stress del RE e metabolismo e la regolazione a feedback dei geni bersaglio di SREBP.

INSIG-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INSIG2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

INSIG-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INSIG2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INSIG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di INSIG-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INSIG2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da INSIG-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via INSIG-2 nelle cellule tumorali con espressione di INSIG2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.