INSIG-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402255-ACT

INSIG2 kodiert INSIG-2, ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER), das die Aktivierung des Sterol-regulatorischen Element-bindenden Proteins (SREBP) hemmt, indem es unter sterolreichen Bedingungen die Retention des SCAP–SREBP-Komplexes im ER fördert. Über diesen sterolabhängigen Kontrollpunkt trägt INSIG-2 dazu bei, die Cholesterin- und Fettsäurebiosynthese mit der zellulären Lipidverfügbarkeit zu koordinieren, und ist mit ER-assoziierten Ubiquitinierungswegen verknüpft, die metabolische Enzyme regulieren. Eine veränderte INSIG2-Expression oder -Funktion wurde mit einer Fehlregulation der Lipogenese und der Cholesterinhomöostase in Verbindung gebracht; berichtet wurden Assoziationen mit metabolischen Phänotypen wie Insulinresistenz, Adipositas-assoziierten Merkmalen und hepatischer Lipidakkumulation. Als Knotenpunkt in Signal- und Stoffwechselwegen wird INSIG-2 häufig genutzt, um die transkriptionelle Kontrolle des Lipidstoffwechsels, das Zusammenspiel von ER-Stress und Metabolismus sowie die Rückkopplungsregulation von SREBP-Zielgenen zu untersuchen.

INSIG-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen INSIG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

INSIG-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des INSIG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der INSIG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen INSIG-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native INSIG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von INSIG-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des INSIG-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem INSIG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.