Plásmido CRISPR de Activación (h) INSIG-1: sc-401381-ACT

INSIG1 codifica el gen inducido por insulina 1 (INSIG-1), una proteína de membrana del retículo endoplásmico (RE) que actúa como sensor de esteroles y regulador negativo central de la biosíntesis de lípidos. INSIG-1 se une a SCAP para retener el complejo SCAP–SREBP en el RE en condiciones de abundancia de esteroles, limitando el procesamiento de SREBP y los programas transcripcionales posteriores que controlan la síntesis de colesterol y ácidos grasos. También interactúa con las vías de degradación acelerada por esteroles al promover la ubiquitinación de la HMG-CoA reductasa, vinculando así la disponibilidad de esteroles con el flujo de la vía del mevalonato. La desregulación de la señalización INSIG1–SREBP se ha implicado en fenotipos metabólicos y en contextos en los que una lipogénesis alterada favorece el crecimiento celular y la adaptación al estrés, lo que la hace relevante para estudios de la homeostasis lipídica, la función del RE y los mecanismos de enfermedades metabólicas.

INSIG-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de INSIG1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

INSIG-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus INSIG1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional INSIG1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de INSIG-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo INSIG1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de INSIG-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía INSIG-1 en células tumorales con expresión de INSIG1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.