IKK-ε CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401786-ACT

IKBKE kodiert IKK-ε, eine nichtkanonische IκB-Kinase, die angeborene Immunerkennung mit entzündlichen Transkriptionsprogrammen verknüpft. IKK-ε phosphoryliert zentrale Signalvermittler und fördert dadurch die Aktivierung von IRF3/IRF7 sowie die NF-κB-abhängige Genexpression; so prägt sie Typ-I-Interferonantworten und die Zytokinproduktion. Durch Crosstalk mit Signalwegen nachgeschaltet von TLRs, RIG-I-ähnlichen Rezeptoren und STING beeinflusst IKK-ε antivirale Abwehrmechanismen, Zellüberleben und Signalwege bei metabolischem Stress. Eine fehlregulierte IKBKE-Aktivität wurde mit persistierenden Entzündungszuständen in Verbindung gebracht und im Kontext tumorassoziierter Signalnetzwerke sowie der Umgestaltung des Immunmikromilieus untersucht.

IKK-ε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IKBKE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IKK-ε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IKBKE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IKBKE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IKK-ε-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IKBKE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IKK-ε-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IKK-ε-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IKBKE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.