Ikaros CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423820-ACT

Das murine Ikzf1 kodiert Ikaros, einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der die Festlegung auf lymphoide Zelllinien und deren Reifung steuert, indem er die Chromatinzugänglichkeit und stadienspezifische Genexpressionsprogramme reguliert. Ikaros ist in transkriptionelle und epigenetische Netzwerke eingebunden, die die Signalübertragung über B‑ und T‑Zell‑Rezeptoren, zytokinresponsive Signalwege sowie Zellzyklus-Checkpoints kontrollieren, um die hämatopoetische Homöostase aufrechtzuerhalten. Störungen der Ikzf1-Expression oder -Funktion werden mit einer fehlregulierten Lymphopoese und aberranter Differenzierung von Immunzellen in Verbindung gebracht, weshalb Ikzf1 häufig im Fokus von Studien zu Mechanismen hämatologischer Erkrankungen und zur Entwicklung des Immunsystems steht.

Ikaros Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ikzf1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ikaros Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ikzf1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ikzf1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ikaros-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ikzf1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ikaros-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ikaros-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ikzf1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.