IGF-1 Receptor α/β/IGF1R CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h2): sc-400084-KO-2

Übersicht

IGF1R kodiert den Insulin-like Growth Factor 1-Rezeptor, eine transmembranäre Rezeptor-Tyrosinkinase, die als α/β-Heterotetramer fungiert und Signale von IGF-Liganden in pro-survivale und wachstumsfördernde Programme überführt. Nach Aktivierung stimuliert IGF1R die kanonischen PI3K–AKT–mTOR- sowie RAS–RAF–MEK–ERK-Kaskaden, ist in die Signalgebung der Insulinrezeptor-Familie eingebunden und beeinflusst Zellzyklusprogression, Apoptoseresistenz, Stoffwechsel und Differenzierung. Die IGF1R-Aktivität prägt Prozesse der Entwicklung und Gewebehomöostase und trägt bei Fehlregulation zu Mechanismen bei, die onkogenes Wachstum, metastatische Eigenschaften und Therapieresistenz zugrunde liegen. Darüber hinaus überschneidet sich die IGF1R-Signalgebung mit Stressantwort- und Adhäsionswegen, was IGF1R zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung von Pathway-Crosstalk und adaptiver Signalgebung in menschlichen Zellen macht.

IGF-1 Receptor α/β/IGF1R CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des IGF1R-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des IGF1R-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das IGF-1 Receptor α/β/IGF1R HDR-Plasmid (h2) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte IGF1R Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem IGF-1 Receptor α/β/IGF1R CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das IGF1R offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des IGF1R-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf IGF1R Exon(e) abzielt, die für die IGF-1 Receptor α/β/IGF1R Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.