HPS-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404200-ACT

HPS1 kodiert HPS-1, eine zentrale Komponente des „biogenesis of lysosome-related organelles complex 3“ (BLOC-3), der den endosomalen Transport und die Reifung spezialisierter sekretorischer Kompartimente reguliert. Über seine Funktion als Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor für Rab32 und Rab38 hilft HPS-1 dabei, die Frachtzustellung zu Lysosomen und lysosomenverwandten Organellen zu koordinieren, und beeinflusst dadurch die Melanosomenbildung, die Biogenese der dichten Granula in Thrombozyten sowie die zugehörige Vesikeldynamik. Eine Störung von HPS1 beeinträchtigt die Organellenbiogenese und den Membrantransport und liefert damit einen mechanistischen Zusammenhang zu Phänotypen des Hermansky–Pudlak-Syndroms, die Pigmentierungsstörungen und eine Blutungsneigung umfassen. Diese Funktionen machen HPS1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung endolysosomaler Signalwege, der Regulation von Rab-GTPasen und der organell-spezifischen Frachtsortierung in menschlichen Zellen.

HPS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HPS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HPS-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HPS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HPS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HPS-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HPS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HPS-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HPS-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HPS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.