hnRNP I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401435-ACT

PTBP1 codifica la proteina umana legante l’RNA hnRNP I, un regolatore multifunzionale dell’espressione genica post-trascrizionale che si lega a motivi ricchi di polipirimidine per controllare lo splicing alternativo, la stabilità dell’mRNA e la traduzione. hnRNP I coordina la scelta dei siti di splicing in concertazione con i componenti core dello spliceosoma e modula programmi di processamento dell’RNA che modellano le transizioni di stato cellulare, inclusi la differenziazione neuronale e l’espressione genica in risposta allo stress. Attraverso la sua influenza sull’inclusione degli esoni, sull’accoppiamento con la degradazione mediata da codoni di stop prematuri (nonsense-mediated decay, NMD) e sulla traduzione dipendente da siti di ingresso interno del ribosoma (IRES), PTBP1 incide su vie coinvolte nel metabolismo, nel controllo del ciclo cellulare e nella sorveglianza dell’RNA. Un’attività deregolata di PTBP1 e il rimodellamento dello splicing sono stati associati alla biologia del cancro e a cambiamenti del trascrittoma legati al neurosviluppo o alla neurodegenerazione, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sul processamento dell’RNA.

hnRNP I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTBP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

hnRNP I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTBP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di hnRNP I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTBP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da hnRNP I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via hnRNP I nelle cellule tumorali con espressione di PTBP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.