HLA-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400627-ACT

HLA-B codifica una catena pesante polimorfica dell’MHC di classe I che si associa alla β2-microglobulina per presentare ai linfociti T CD8+ peptidi derivati da proteine intracellulari, contribuendo alla sorveglianza immunitaria e alle risposte citotossiche. La sua espressione è strettamente regolata dai segnali indotti dagli interferoni e dalle vie di processamento e presentazione dell’antigene, inclusa la generazione proteasomiale dei peptidi e il loro trasporto nel reticolo endoplasmatico mediato da TAP. Le variazioni di HLA-B influenzano il repertorio peptidico e modulano l’alloriconoscimento e le interazioni ospite–patogeno, collegando questo locus alla suscettibilità alle malattie immuno-mediate e alla compatibilità nei trapianti. Alterazioni dell’espressione di HLA-B o dell’uso allelico sono rilevanti anche negli studi sull’elusione immunitaria e sui microambienti infiammatori, in cui la presentazione dell’antigene viene rimodellata dinamicamente.

HLA-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HLA-B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HLA-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HLA-B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HLA-B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HLA-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HLA-B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HLA-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HLA-B nelle cellule tumorali con espressione di HLA-B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.