Plasmide CRISPR d'Activation (h) HIF PHD2: sc-403334-ACT

EGLN1 code pour HIF PHD2, une prolyl-hydroxylase dépendante du 2‑oxoglutarate et du Fe(II) qui hydroxyle les sous-unités HIF‑α en normoxie, permettant leur reconnaissance par von Hippel–Lindau (VHL) et leur dégradation par le protéasome. Par cette voie de détection de l’oxygène, HIF PHD2 module des programmes transcriptionnels contrôlant l’angiogenèse, l’érythropoïèse, le métabolisme glycolytique, l’adaptation mitochondriale et la survie cellulaire en situation de stress hypoxique. Une activité altérée d’EGLN1/PHD2 influence l’amplitude de la signalisation HIF et a été associée à des phénotypes d’adaptation à l’hypoxie ainsi qu’à des maladies caractérisées par une homéostasie de l’oxygène déréglée, notamment en cancérologie, dans le remodelage vasculaire pulmonaire et dans des mécanismes liés à l’érythrocytose. En tant que nœud central de la détection cellulaire de l’oxygène, EGLN1 est largement étudié pour ses effets sur les réseaux de gènes induits par l’hypoxie et la reprogrammation métabolique.

HIF PHD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EGLN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HIF PHD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EGLN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EGLN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HIF PHD2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EGLN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HIF PHD2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HIF PHD2 dans les cellules tumorales présentant une expression de EGLN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.