Plásmido CRISPR de Activación (h) Hemoglobin δ: sc-401567-ACT

HBD codifica la cadena de globina delta de la hemoglobina humana, un componente central de la hemoglobina adulta A2 que contribuye al transporte de oxígeno en los eritrocitos y a la homeostasis redox. La expresión de la globina delta está estrechamente acoplada a los programas de diferenciación eritroide y a la transcripción mediada por la región de control del locus de globinas, integrándose con las vías de biosíntesis del hemo, el manejo del hierro y el ensamblaje de la hemoglobina. Las variaciones en la expresión o en la secuencia de HBD pueden influir en la composición de la hemoglobina y sirven como lectura molecular en estudios sobre el cambio de globinas (globin switching) y la eritropoyesis. El desequilibrio en la proporción de cadenas de globina es relevante en los trastornos hereditarios de la hemoglobina, donde con frecuencia se investigan cambios compensatorios en fracciones menores de hemoglobina como modificadores de la biología de la enfermedad.

Hemoglobin δ El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HBD sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Hemoglobin δ El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HBD en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HBD, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Hemoglobin δ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HBD y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Hemoglobin δ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Hemoglobin δ en células tumorales con expresión de HBD silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.