HEL308 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-404447-LAC

HELQ umano codifica l’elicasi del DNA HEL308, un’elicasi ATP-dipendente 3′→5′ che promuove la stabilità del genoma elaborando forcelle di replicazione bloccate e intermedi della ricombinazione. HEL308/HELQ svolge un ruolo nella tolleranza al danno del DNA, nelle risposte allo stress replicativo e nella riparazione dei crosslink interfilamento, interfacciandosi con la ricombinazione omologa e la segnalazione del checkpoint della fase S per limitare le aberrazioni cromosomiche. L’alterazione o la disregolazione delle vie associate a HELQ è stata collegata a un recupero compromesso delle forcelle di replicazione e a un aumentato carico mutazionale, rendendolo rilevante per studi sulla suscettibilità al cancro e sui fenotipi da deficit di riparazione del DNA. In quanto elicasi accoppiata alla replicazione, HEL308 è spesso analizzata in contesti in cui la protezione della forcella, l’aggiramento delle lesioni e il controllo della ricombinazione determinano il destino cellulare sotto stress genotossico.

Le particelle di attivazione lentivirale HEL308 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di HELQ in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HEL308 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione HELQ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HEL308. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo HELQ e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.