HAS2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420798-ACT

Il gene murino Has2 codifica la ialuronano sintasi 2 (HAS2), un enzima di membrana plasmatica che polimerizza l’ialuronano, uno dei principali glicosaminoglicani della matrice extracellulare. La produzione di ialuronano guidata da HAS2 modula l’organizzazione della matrice pericellulare, l’idratazione e la meccanotrasduzione, influenzando migrazione, adesione e proliferazione cellulare tramite interazioni con recettori quali CD44 e RHAMM. La regolazione di Has2 collega la morfogenesi dello sviluppo e il rimodellamento tissutale a reti di segnalazione che includono TGF-β, ERK/MAPK e segnali infiammatori che rimodellano la dinamica della matrice extracellulare. Alterazioni dell’attività di HAS2 e dell’abbondanza di ialuronano sono associate a rimodellamento fibrotico, patologie vascolari e biologia del microambiente tumorale, rendendo Has2 un nodo utile per studiare fenotipi dipendenti dalla matrice in vivo e in colture di cellule murine.

HAS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Has2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HAS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Has2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Has2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HAS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Has2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HAS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HAS2 nelle cellule tumorali con espressione di Has2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.