G_{α 15} CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403266-ACT

GNA15 kodiert die heterotrimere G‑Protein‑α‑Untereinheit Gα15, ein Mitglied der Gq‑Familie, die unterschiedliche G‑Protein‑gekoppelte Rezeptoren mit der Aktivierung der Phospholipase C‑β koppelt. Diese Signalachse treibt die Bildung von Inositoltrisphosphat und Diacylglycerol, die Mobilisierung von Calcium sowie PKC‑abhängige Transkriptionsprogramme an, die die Aktivierung von Immun- und hämatopoetischen Zellen prägen. Gα15 ist in Leukozytenlinien angereichert und kann die Spezifität der Rezeptorkopplung erweitern, wodurch Chemotaxis, Zytokinfreisetzung und stressresponsive Genexpression beeinflusst werden. Eine fehlregulierte GPCR–Gα15‑Signalübertragung wurde in krankheitsrelevanten zellulären Kontexten mit aberranter inflammatorischer Signalgebung sowie veränderter Aktivität von Wachstumsfaktor- und MAPK‑Signalwegen in Verbindung gebracht.

Gα 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNA15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gα 15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNA15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNA15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gα 15-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNA15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gα 15-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gα 15-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNA15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.