Plasmide CRISPR d'Activation (h) GS28: sc-404357-ACT

Le gène humain **GOSR1** code le composant du complexe récepteur SNAP du Golgi **GS28**, une SNARE de trafic vésiculaire qui soutient le transport rétrograde dépendant de COPI et la fusion des membranes au sein du Golgi. En coordonnant la dynamique RE–Golgi et celle des empilements golgiens, GS28 contribue au maintien de l’architecture du Golgi, de la capacité de glycosylation et d’un tri fidèle des cargos tout au long de la voie sécrétoire. Les perturbations du transport médié par les SNARE sont associées à des réponses au stress cellulaire, à une protéostasie altérée et à des programmes de trafic dérégulés, fréquemment étudiés dans la neurodégénérescence, la biologie des infections et les phénotypes sécrétoires des cellules cancéreuses. En tant que composant central de la machinerie de fusion membranaire, GS28 constitue un nœud expérimental accessible pour disséquer l’influence du transport golgien sur la signalisation, l’homéostasie des organites et la maturation des protéines.

GS28 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GOSR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GS28 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GOSR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GOSR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GS28. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GOSR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GS28 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GS28 dans les cellules tumorales présentant une expression de GOSR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.