Plasmide CRISPR d'Activation (h) GS1: sc-405996-ACT

La PUDP humaine (pseudouridine 5′-phosphatase), également appelée GS1, est une enzyme cytosolique du réseau de récupération des pyrimidines qui déphosphoryle la pseudouridine 5′-monophosphate en pseudouridine, soutenant le renouvellement et le recyclage des nucléosides modifiés issus du catabolisme de l’ARN. En régulant les niveaux de nucléotides de pseudouridine, la PUDP influence l’homéostasie des nucléotides et s’interface avec des voies qui gouvernent la dynamique des modifications de l’ARN, le métabolisme des ribonucléotides et les réponses cellulaires au stress métabolique. Une altération de la prise en charge des nucléosides modifiés est de plus en plus associée à une dérégulation du renouvellement de l’ARN et à une reprogrammation métabolique observées dans divers contextes pathologiques, ce qui fait de la PUDP un nœud utile pour des études mécanistiques. La modulation de l’expression de PUDP/GS1 permet d’examiner comment le métabolisme de la pseudouridine influence les programmes d’expression génique et la physiologie cellulaire.

GS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PUDP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PUDP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PUDP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GS1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PUDP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GS1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GS1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PUDP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.