Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRAMD1B: sc-408929-ACT

Le gène humain **GRAMD1B** code une protéine associée aux membranes contenant un domaine GRAM, impliquée dans le transport intracellulaire des stérols et dans l’organisation des sites de contact entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Grâce à la détection des lipides médiée par son domaine GRAM et à son recrutement vers des compartiments membranaires spécifiques, GRAMD1B est associée à l’homéostasie du cholestérol, à la composition membranaire et à des processus de signalisation dépendants des lipides qui influencent le trafic vésiculaire et les réponses au stress cellulaire. Des altérations de l’expression de GRAMD1B ont été rapportées dans des études génomiques et transcriptomiques dans de multiples contextes pathologiques, notamment le cancer et des affections liées à l’immunité, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques des voies couplées au métabolisme lipidique. L’analyse fonctionnelle de GRAMD1B aide à préciser comment la distribution des stérols et la dynamique des contacts membranaires modulent la régulation de l’état cellulaire et les sorties des réseaux de signalisation.

GRAMD1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRAMD1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRAMD1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRAMD1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRAMD1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRAMD1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRAMD1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRAMD1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRAMD1B dans les cellules tumorales présentant une expression de GRAMD1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.