GRAF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403652-ACT

ARHGAP26 kodiert GRAF, ein Rho-GTPase-aktivierendes Protein, das die Signalübertragung der Rho-Familie herunterreguliert, um den Umbau des Aktinzytoskeletts, den Membrantransport und die Dynamik fokaler Adhäsionen zu koordinieren. Durch Interaktionen mit endozytotischen und zytoskelettalen Regulatoren trägt GRAF zur Kontrolle von Zellmorphologie, Migration und Rezeptor-Internalisierung bei und verknüpft RhoA-abhängige Signalwege mit der Vesikeldynamik. Eine fehlregulierte ARHGAP26-Aktivität wurde mit veränderten Programmen der Zellbeweglichkeit und -adhäsion in Verbindung gebracht und im Kontext onkogener Signalgebung sowie hämatologischer Krankheitsmechanismen untersucht, die mit einer aberranten Regulation von Rho-GTPasen einhergehen.

GRAF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARHGAP26-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRAF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARHGAP26-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARHGAP26-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRAF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARHGAP26-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRAF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRAF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARHGAP26-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.