GPR41 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402190-ACT

FFAR3 kodiert den G‑Protein-gekoppelten Rezeptor GPR41, einen Zelloberflächen-Sensor für kurzkettige Fettsäuren wie Propionat und Butyrat, die aus der mikrobiellen Fermentation stammen. Nach Ligandenbindung koppelt GPR41 überwiegend an Gi/o-Signalwege, senkt dadurch den cAMP-Spiegel und moduliert nachgeschaltete Signalwege, die den zellulären Stoffwechsel, die Energiehomöostase und den Entzündungsstatus beeinflussen. Die Aktivität von FFAR3/GPR41 wird mit der Regulation der Hormonsekretion und der neuroimmunen Kommunikation in Verbindung gebracht und positioniert den Rezeptor an der Schnittstelle zwischen Darm‑Mikrobiom-Signalen und der Physiologie des Wirts. Eine dysregulierte FFAR3-Signalgebung ist daher in Studien zu Stoffwechselstörungen und Mechanismen entzündlicher Erkrankungen von Interesse, bei denen die GPCR-vermittelte Nährstoffsensorik gestört ist.

GPR41 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FFAR3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR41 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FFAR3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FFAR3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR41-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FFAR3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR41-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR41-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FFAR3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.