GPNMB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402966-ACT

GPNMB (glicoproteina non metastatica del melanoma, proteina B) è una glicoproteina transmembrana di tipo I arricchita nelle cellule della linea mieloide e nelle popolazioni melanocitiche, dove contribuisce all’adesione cellulare, alla migrazione e al rimodellamento tissutale. È coinvolta in processi associati a lisosomi ed endosomi e può modulare la segnalazione infiammatoria e la funzione delle cellule presentanti l’antigene attraverso interazioni con la matrice extracellulare e con partner immunoregolatori. Un’alterata espressione di GPNMB è stata riportata in diversi contesti, tra cui la biologia del melanoma, la neuroinfiammazione, la fibrosi e il rimodellamento del microambiente tumorale–immunitario, rendendola un marcatore utile e un nodo meccanicistico negli studi sull’adattamento allo stress e sui programmi di differenziamento cellulare. In vitro, la regolazione di GPNMB viene spesso studiata insieme alle vie che controllano la polarizzazione dei macrofagi, l’attività degli osteoclasti e fenotipi di tipo epitelio–mesenchimale.

GPNMB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPNMB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPNMB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPNMB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPNMB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPNMB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPNMB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPNMB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPNMB nelle cellule tumorali con espressione di GPNMB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.