GnT-V CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403921-ACT

Humanes MGAT5 kodiert die N‑Acetylglucosaminyltransferase V (GnT‑V), eine im Golgi lokalisierte Glykosyltransferase, die die β1,6‑GlcNAc‑Verzweigung von N‑Glykanen katalysiert. Diese Modifikation erhöht die Glykan‑Komplexität auf Zelloberflächen‑ und sezernierten Glykoproteinen und beeinflusst die Verweildauer von Rezeptoren, die Ligandenantwort sowie nachgeschaltete Signalübertragung über Signalwege wie EGFR/MAPK und PI3K/AKT. Durch die Umgestaltung der Glykanlandschaft trägt MGAT5 zur Regulation von Zell‑Zell‑Adhäsion, Migration und der Funktion von Immunrezeptoren bei – unter anderem über galectinvermittelte Gitterbildung (Lattice) und verändertes Trafficking. Eine dysregulierte MGAT5‑Aktivität und β1,6‑Verzweigung wurden mit Veränderungen der Invasivität von Tumorzellen, metastatischen Phänotypen und Immunmodulation in Verbindung gebracht, weshalb MGAT5 häufig im Fokus von Studien zur Krebs‑Glykobiologie und zur Signalgebung im Mikromilieu steht.

GnT-V Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MGAT5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GnT-V Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MGAT5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MGAT5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GnT-V-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MGAT5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GnT-V-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GnT-V-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MGAT5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.